Racun ula ngandhut enzim sing nghidrolisis ikatan ester karboksil.Substrat kanggo hidrolisis yaiku fosfolipid, asetilkolin lan asetat aromatik.Enzim kasebut kalebu telung jinis: fosfolipase, asetilkolinesterase lan esterase aromatik.Arginine esterase ing racun ula uga bisa nghidrolisis arginin sintetik utawa lisin, nanging utamane nghidrolisis ikatan peptida protein ing alam, saengga kalebu protease.Enzim sing dibahas ing kene mung tumindak ing substrat ester lan ora bisa tumindak ing ikatan peptida.Ing antarane enzim kasebut, fungsi biologi acetylcholinesterase lan fosfolipase luwih penting lan wis diteliti kanthi lengkap.Sawetara racun ula nduweni aktivitas esterase aromatik sing kuwat, sing bisa nghidrolisis p-nitrophenyl ethyl ester, a - utawa P-naftalena asetat lan etil ester indole.Isih ora dingerteni apa aktivitas iki diprodhuksi dening enzim independen utawa efek samping karboksilesterase sing dikenal, apamaneh makna biologis.Nalika racun Agkistrodon halys Japonicus direaksikan karo p-nitrophenyl ethyl ester lan indole ethyl ester, hidrolisat p-nitrophenol lan indole phenol ora ditemokake;Kosok baline, yen ester kasebut bereaksi karo racun ula subspesies kobra Zhoushan lan racun ula Bungarus multicinctus, dheweke bakal cepet dihidrolisis.Dikenal yen racun kobra iki nduweni aktivitas kolinesterase sing kuat, sing bisa uga tanggung jawab kanggo hidrolisis substrat ing ndhuwur.Nyatane, Mclean et al.(1971) nglapurake yen akeh racun ula sing kalebu kulawarga Cobra bisa nghidrolisis etil ester indole, etil ester naftalena lan ester butil naftalena.Ular ula iki asalé saka: kobra, kobra leher ireng, kobra lambe ireng, kobra emas, kobra Mesir, kobra raja, kobra mas, mamba ireng lan mamba lambe putih (D. aw isih ngerti ula ketupat wetan.
Racun ula bisa nghidrolisis metil indole etil ester, yaiku substrat kanggo nemtokake aktivitas kolinesterase ing serum, nanging racun ula iki ora nuduhake aktivitas kolinesterase.Iki nuduhake yen ana esterase sing ora dingerteni ing racun kobra, sing beda karo kolinesterase.Kanggo mangerteni sifat enzim iki, perlu kerja pemisahan luwih lanjut.
1. Fosfolipase A2
(I) Gambaran Umum
Phospholipase minangka enzim sing bisa nghidrolisis gliseril fosfat.Ana 5 jinis fosfolipase ing alam, yaiku fosfolipase A2 lan fosfolipase.
A. , fosfolipase B, fosfolipase C lan fosfolipase D. Racun ula utamané ngandhut fosfolipase A2 (PLA2), sawetara racun ula ngandhut fosfolipase B, lan fosfolipase liyané utamané ditemokake ing jaringan kewan lan bakteri.Gambar 3-11-4 nuduhake situs aksi fosfolipase kasebut ing hidrolisis substrat.
Antarane fosfolipase, PLA2 wis diteliti luwih akeh.Bisa uga enzim sing paling diteliti ing racun ula.Substrat kasebut minangka ikatan ester ing posisi kapindho Sn-3-gliserofosfat.Enzim iki akeh ditemokake ing racun ula, racun tawon, racun kalajengking lan jaringan kewan, lan PLA2 akeh banget ing papat racun ula kulawarga.Amarga enzim iki ngrusak sel getih abang lan nyebabake hemolisis, uga diarani "hemolysin".Sawetara wong uga nyebat lecithinase hemolitik PLA2.
Ludeeke pisanan nemokake yen racun ula bisa ngasilake senyawa hemolitik kanthi tumindak lesitin liwat enzim.Mengko, Delezenne et al.mbuktekaken yen racun kobra tumindak ing serum jaran utawa kuning telur, iku mbentuk zat hemolitik.Saiki dikenal yen PLA2 bisa langsung tumindak ing fosfolipid saka membran eritrosit, ngrusak struktur membran eritrosit lan nyebabake hemolisis langsung;Bisa uga tumindak ing serum utawa lesitin sing ditambahake kanggo ngasilake lesitin hemolitik, sing tumindak ing sel getih abang kanggo ngasilake hemolisis ora langsung.Senajan PLA2 akeh banget ing papat kulawarga racun ula, isi enzim ing macem-macem racun ula rada beda.Ular Ular (C
Racun ula mung nuduhake aktivitas PLA2 sing lemah.Tabel 3-11-11 nggambarake perbandingan aktivitas PLA2 saka 10 racun utama ula berbisa ing China.
Tabel 3-11-11 Perbandingan aktivitas fosfolipase VIII saka 10 racun ula ing China
Racun ular
Pelepasan lemak
Asam alifatik,
Cjumol/mg)
Aktivitas hemolitik CHU50/^ g * ml)
Racun ular
Ngeculake asam lemak
(^raol/mg)
Aktivitas hemolitik "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
sewelas
Micracephal ophis
limang titik siji nul
kalyspallas
8. 68
rong ewu wolung atus
gracilis
V, akut
7. 56
** #
Ophiophagus hannah
telu koma wolu loro
satus patang puluh
Bnugarus fasctatus
7,56
rong atus wolung puluh
B. multicinctus
siji titik sanga enem
rong atus wolung puluh
Viper lan russelli
pitung nol telu
T, mucrosquamatus
siji titik wolu lima
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Pemisahan lan purifikasi
Isi PLA2 ing ula ula gedhe, lan iku stabil kanggo panas, asam, alkali lan denaturant, supaya gampang kanggo purify lan misahake PLA2.Cara sing umum yaiku kanggo nindakake filtrasi gel dhisik ing racun mentah, banjur nindakake kromatografi pertukaran ion, lan langkah sabanjure bisa diulang.Perlu dicathet yen beku-pangatusan PLA2 sawise kromatografi ion-ijol-ijolan ngirim ora nyebabake agregasi, amarga proses beku-pangatusan asring nambah kekuatan ion ing sistem, kang minangka faktor penting nyebabake agregasi PLA2.Saliyane cara umum ing ndhuwur, cara ing ngisor iki uga diadopsi: ① Wells et al.② Analog substrat saka PLA2 digunakake minangka ligan kanggo kromatografi afinitas.Ligan iki bisa ikatan karo PLA2 ing racun ula kanthi Ca2+.EDTA biasane digunakake minangka eluent.Sawise Ca2+ dibusak, afinitas antarane PLA2 lan ligan mudhun, lan bisa dipisahake saka ligan.Liyane nggunakake solusi organik 30% utawa 6mol / L urea minangka eluen.③ Kromatografi hidrofobik ditindakake kanthi PheiiylSephar0SeCL-4B kanggo mbusak jejak PLA2 ing kardiotoksin.④ Antibodi anti PLA2 digunakake minangka ligan kanggo nindakake kromatografi afinitas ing PLA2.
Nganti saiki, akeh racun ula PLAZ wis diresiki.Tu et al.(1977) kadhaptar PLA2 diresiki saka racun ula sadurunge 1975. Ing taun-taun pungkasan, akeh artikel babagan pamisahan lan pemurnian PLA2 wis dilaporake saben taun.Ing kene, kita fokus ing pamisahan lan pemurnian PLA dening sarjana Cina.
Chen Yuancong et al.(1981) misahake telung spesies PLA2 saka racun Agkistrodon halys Pallas ing Zhejiang, sing bisa dipérang dadi PLA2 asam, netral lan alkalin miturut titik isoelektrik.Miturut keracunan, PLA2 netral luwih beracun, sing wis diidentifikasi minangka neurotoksin presinaptik Agkistrodotoxin.PLA2 alkalin kurang beracun, lan PLA2 asam meh ora beracun.Wu Xiangfu et al.(1984) mbandhingake karakteristik telung PLA2, kalebu bobot molekul, komposisi asam amino, N-terminal, titik isoelektrik, stabilitas termal, aktivitas enzim, keracunan lan aktivitas hemolitik.Asil kasebut nuduhake manawa bobot molekul lan stabilitas termal padha, nanging bedane signifikan ing aspek liyane.Ing aspek aktivitas enzim, aktivitas enzim asam luwih dhuwur tinimbang aktivitas enzim alkalin;Efek hemolitik enzim alkali ing sel getih abang tikus paling kuat, disusul enzim netral, lan enzim asam meh ora hemolisis.Mulane, spekulasi yen efek hemolitik PLAZ ana hubungane karo muatan molekul PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) wis nggawe kristal Agkistrodotoxin.Tu Guangliang et al.(1983) nyatakake yen PLA beracun kanthi titik isoelektrik 7. 6 diisolasi lan diresiki saka racun Vipera rotundus saka Fujian, lan sifat fisik lan kimia, komposisi asam amino lan urutan 22 residu asam amino ing N. -terminal ditemtokake.Li Yuesheng et al.(1985) ngisolasi lan ngresiki PLA2 liyane saka racun Viper rotundus ing Fujian.Subunit PLA2 * yaiku 13.800, titik isoelektrik yaiku 10.4, lan aktivitas spesifik yaiku 35/xnioI/miri mg. Kanthi lesitin minangka substrat, pH optimal enzim yaiku 8.0 lan suhu optimal yaiku 65 ° C. LD5 disuntikake intravena ing tikus.Iki 0,5 ± 0,12 mg / kg.Enzim iki nduweni efek antikoagulan lan hemolitik sing jelas.Molekul PLA2 beracun kasusun saka 123 residu saka 18 jinis asam amino.Molekul iki sugih ing sistein (14), asam aspartat (14) lan glisin (12), nanging mung ngandhut siji methionine, lan N-terminal sawijining residu serine.Dibandhingake karo PLA2 sing diisolasi dening Tuguang, bobot molekul lan jumlah residu asam amino saka rong isoenzim kasebut meh padha, lan komposisi asam amino uga meh padha, nanging jumlah residu asam aspartat lan prolin rada beda.Guangxi king cobra snake venom ngandhut sugih PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) ngisolasi PLA2 saka racun, sing nduweni aktivitas spesifik 3,6 kaping luwih dhuwur tinimbang racun asli, bobot molekul 13000, komposisi 122 residu asam amino, titik isoelektrik 8,9, lan stabilitas termal sing apik.Saka pengamatan mikroskop elektron saka efek saka PLA2 dhasar ing sel getih abang, iku bisa katon sing wis efek ketok ing membran sel getih abang manungsa, nanging wis ora efek ketok ing sel getih abang wedhus.PLA2 iki nduweni efek retardasi sing jelas ing kacepetan elektroforesis sel getih abang ing manungsa, wedhus, terwelu lan marmut.Chen et al.Enzim iki bisa nyandhet agregasi platelet sing disebabake dening ADP, kolagen lan asam arakidonat natrium.Nalika konsentrasi PLA2 10/xg/ml~lOOjug/ml, agregasi trombosit rampung dicegah.Yen trombosit sing wis dikumbah digunakake minangka bahan, PLA2 ora bisa nyegah agregasi ing konsentrasi 20Mg / ml.Aspirin minangka inhibitor cyclooxygenase, sing bisa nyegah efek PLA2 ing trombosit.PLA2 bisa nyandhet agregasi trombosit kanthi hidrolisis asam arakidonat kanggo sintesis tromboksan A2.Konformasi solusi PLA2 sing diprodhuksi dening racun Agkistrodon halys Pallas ing Provinsi Zhejiang diteliti kanthi cara dichroism bunder, fluoresensi lan penyerapan UV.Asil eksperimen nuduhake yen konformasi rantai utama enzim iki padha karo jinis enzim sing padha saka spesies lan genera liyane, konformasi kerangka nduweni resistensi panas sing apik, lan owah-owahan struktural ing lingkungan asam bisa dibalik.Kombinasi aktivator Ca2+ lan enzim ora mengaruhi lingkungan residu triptofan, dene inhibitor Zn2+ tumindak sebaliknya.Cara nilai pH larutan mengaruhi aktivitas enzim beda karo reagen ing ndhuwur.
Ing proses pemurnian PLA2 saka racun ula, fenomena sing jelas yaiku yen racun ula ngandhut loro utawa luwih puncak elusi PLA2.Fenomena iki bisa diterangake kaya ing ngisor iki: ① amarga anane isozim;② Siji jinis PLA2 dipolimerisasi dadi macem-macem campuran PLA2 kanthi macem-macem bobot molekul, sing paling akeh ana ing kisaran 9 000 ~ 40 000;③ Kombinasi saka PLA2 lan komponen racun ula liyane complicates PLA2;④ Amarga ikatan amida ing PLA2 dihidrolisis, muatan kasebut owah.① Lan ② umum, mung sawetara pangecualian, kayata PLA2 ing CrWa/w racun ula
Ana rong kahanan: ① lan ②.Kondisi katelu ditemokake ing PLA2 ing racun ula ing ngisor iki: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, ular weling Palestina, ular weling wedhi, lan ular weling sing nggegirisi.
Asil kasus ④ ndadekake kacepetan migrasi PLA2 owah-owahan sajrone elektroforesis, nanging komposisi asam amino ora owah.Peptida bisa rusak kanthi hidrolisis, nanging umume isih kaiket kanthi ikatan disulfida.Rattlesnake pit wétan ngemot rong bentuk PLA2, sing diarani tipe a lan tipe p PLA2.Bedane antarane rong jinis PLA2 iki mung siji asam amino, yaiku, glutamin ing siji molekul PLA2 diganti karo asam glutamat ing molekul PLA2 liyane.Sanajan alesan sing tepat kanggo prabédan iki ora jelas, umume dipercaya manawa ana hubungane karo deaminasi PLA2.Yen PLA2 ing racun viper Palestina tetep anget karo racun mentah, klompok pungkasan ing molekul enzim bakal dadi luwih akeh tinimbang sadurunge.Saka C PLA2 sing diisolasi saka racun ula nduweni rong terminal N sing beda-beda, lan bobot molekule yaiku 30000. Fenomena iki bisa uga disebabake dening dimer asimetris PLA2, sing padha karo dimer simetris sing dibentuk dening PLA2 ing racun ular berlian timur. lan kulon diamondback rattlesnake.Kobra Asia kasusun saka pirang-pirang subspesies, sawetara sing ora pati jelas ing klasifikasi.Contone, sing biyen diarani subspesies Cobra Outer Caspian saiki diakoni
Iku kudu lantaran kanggo Outer Caspian Sea Cobra.Amarga ana akeh subspesies lan dicampur bebarengan, komposisi racun ula beda-beda banget amarga macem-macem sumber, lan isi isozim PLA2 uga dhuwur.Contone, racun kobra
Paling ora ana 9 jinis isozim PLA2 saka spesies r ^ ll ditemokake, lan 7 jinis isozim PLA2 ditemokake ing racun subspesies kobra Caspian.Durkin et al.(1981) nyinaoni isi PLA2 lan jumlah isozim ing macem-macem bisa ula, kalebu 18 bisa ular kobra, 3 bisa mamba, 5 bisa ula, 16 bisa ula lan 3 bisa ula segara.Umumé, aktivitas PLA2 saka racun kobra dhuwur, kanthi akeh isozim.Aktivitas PLA2 lan isozim racun viper medium.Aktifitas PLA2 saka racun mamba lan racun ula rattlesnake kurang banget utawa ora ana aktivitas PLA2.Aktivitas PLA2 saka racun ula laut uga kurang.
Ing taun-taun pungkasan, durung kacarita yen PLA2 ing racun ula ana ing wangun dimer aktif, kayata rhombophora wetan rattlesnake (C. wisa ula ngandhut tipe a lan tipe P PLA2, loro-lorone kasusun saka rong subunit sing padha. , lan mung dimerase wis
Kegiatan.Shen et al.uga ngusulake yen mung dimer PLA2 saka racun ula minangka wangun aktif enzim kasebut.Panliten babagan struktur spasial uga mbuktekake manawa PLA2 saka ular berlian intan kulon ana ing wangun dimer.Senyawa piscivorous
Ana rong beda PLA ^ Ei lan E2 saka racun ula, sing 仏 ana ing wangun dimer, dimer aktif, lan monomer disosiasi ora aktif.Lu Yinghua et al.(1980) luwih nyinaoni sifat fisik lan kimia lan kinetika reaksi E. Jayanthi et al.(1989) ngisolasi PLA2 dhasar (VRVPL-V) saka racun viper.Bobot molekul monomer PLA2 yaiku 10000, sing nduweni efek mateni, antikoagulan lan edema.Enzim bisa polimerisasi polimer kanthi bobot molekul sing beda-beda miturut kondisi PH 4.8, lan tingkat polimerisasi lan bobot molekul polimer mundhak kanthi kenaikan suhu.Bobot molekul polimer sing diasilake ing 96 ° C yaiku 53.100, lan aktivitas PLA2 saka polimer iki mundhak loro.
Wektu kirim: Nov-18-2022